你的位置:主页 > 娱乐节目 >

二代测序(NGS)试验计划设计和应用.doc 8页

2020-04-11 | 人围观

  实用文案

  规范文档

  这里为您引见二代测序的相干流程和应用。

  随着人类基因组工程的完成,关于低破费的测序技巧的需求促进了高通量二代测序技巧的开展。这些新的测序平台许可停止高通量测序,具有遍及的应用:

  全基因组从头测序或许重测序

  目标序列重测序

  转录组剖析

  微生物组研究

  基因调控研究

  NGS 序列 二代测序仪器有很多种组合,在通量、片段长度、准确度、每轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格和技巧方面存在存在差异。? 从规格和初始成本的角度而言,二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围,也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器。 台式测序仪使得任何试验室都可以像应用real-time PCR一样,自己停止测序。这些仪器可以和一些靶标序列富集技巧相联合,用在一些临床的应用中,个中:选定的靶标基因用于深度剖析,以检测罕见的突变,或许检测多样样本中(比如癌症样本)中的突变。今朝,这些仪器的通量在10 Mb到7.5 Gb之间,然则随着硬件,软件和试剂的继续改良,通量也在稳步添加。 高通量测序仪十分适宜于少量的,基因组范围的研究,每次测序能测定600 Gb的序列。一些如许的高通量和高精度的平台,能测定的片段长度相对较短,这关于高重复性的序列和未知基因组的从头测序就可以够成为后果。与此相反,也有一些仪器能测序的片段较长(到达2500 bp),然则其精度和测序才华(90 Mb)要低很多。还有一些测序才华位于二者之间的仪器(~800 bp,700 Mb)。 因此,应用决定了哪一种仪器是最适宜的。 有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。这类技巧中,依据一个DNA链经过一个分化的或许蛋白纳米孔道所惹起的电流的修改,可以肯定经过这个孔道的碱基。这实际上可以仅用一步就测序一个完整的染色体,而不需求生成新的DNA链。 DNA测序 二代DNA测序的任务流程以下:

  DNA样本制备

  文库构建和验证

  文库分子大年夜范围平行克隆扩增

  测序

  ? 二代测序DNA样本的质量控制 起首,评价基因组DNA的质量是十分需要的(完整性和纯度)。 凝胶电泳法 基因组DNA的完整性和大年夜小,可以用惯例或许脉冲场琼脂糖凝胶电泳(PFGE)来检测。惯例的凝胶电泳的准确度不高,这是因为大年夜的DNA分子在凝胶中移动的时分,实质上是用一种与尺寸有关的方法一同移动的。然则,它依然可以供给完整性(大年夜小范围)和纯度(RNA污染物在凝胶底部构成脱尾条带)方面的有效信息。因此,它依然是评价基因组DNA质量的有效方法之一。 注:RNA污染会招致DNA浓度高估,而且抑制一些下流步调。假设能必然有RNA污染,则可应用去DNase的RNase I处理样本。 分光光度测定法 分光光度仪在260 nm和280 nm处读数的比例(A260/A280)可以用来估计DNA相干于一些接收紫外光的杂质(比如蛋白)的纯度。纯粹的DNA的A260/A280比例大年夜约为1.7–1.9。 注:想要取得准确的A260/A280值,需求在弱碱性的缓冲溶液中测定吸光度(比如, 10 mM Tris?Cl, pH 7.5)。 第二个步调是测定基因组DNA的浓度。 分光光度法 DNA的浓度可以经过应用分光光度仪测定其在260 nm波长的吸光度来肯定。Nanodrop今朝被遍及应用,因为它需求的样本量少(1 μl),而且应用便利(不需求比色皿)。为了确保结果的牢靠性,读数应当在0.1到1.0之间。? 注:吸光度测定不能差别DNA和RNA。RNA污染物会招致DNA浓度高估。然则,纯粹RNA的A260/A280比值在2.0摆布,而纯粹的DNA大年夜约为1.8。因此,假设这个值为1.95,那么说明样本外面有RNA杂质。 注:苯酚在270–275 nm的波长范围内有十分的吸光度,十分接近于DNA。因此苯酚能提高样本在260 nm左近的吸光度,从而招致高估DNA的产量和纯度。 荧光法 荧光法应用荧光染料测定DNA的浓度,具有特异性和灵敏性。Hoechst 33258联合到DNA上后,能增大年夜458 nm波长左近的发光强度,除此以外,也能够应用一些越发灵敏的荧光染料,比如PicoGreen染料。基于PicoGreen染料的试验,比紫外吸光光度法灵敏10,000倍,而比应用Hoechst 33258染料的方法至少灵敏400倍。和紫外吸光光度法分歧,PicoGreen试验对双链DNA的选择性要远高于RNA和单链DNA。 DNA规范品和样本与荧光染料混淆,而且应用荧光计检测。将样本的测定结果与规范品的测定结果比拟拟,以肯定DNA的浓度。 Real-time PCR? 可以应用real-time PCR 技巧来测定DNA样本的数量和质量。多重PCR技巧应用引物集在多个位点扩增分歧大年夜小的片段,是检测DNA毁伤和片段化的有效质控手腕。

标签:

相关内容推荐:

Top